Medvědi, křečci, humanoidi. Je křeček nebo medvěd z hlediska bioinformatiky bratr člověka? / Habr

Abychom na tuto otázku odpověděli, je ve vědeckém výzkumu nutné definovat účel, cíle a metody a materiály, které budou studovány. K tomu je třeba se pokusit předem formulovat hypotézu, která nám usnadní pochopení toho, co chceme, a umožní nám tedy vybrat výzkumné materiály. Jako hypotézu se můžete spolehnout na své znalosti v oblasti klasifikace skupin zvířat. Pokud však takové znalosti nemáte a nechcete se trápit hledáním těchto znalostí na polích, v lesích a laboratořích, můžete se stát pokročilým uživatelem internetu a využít pohodlný web lifemap [1], který zobrazuje fylogenetický strom všech zvířat. Pokud nejste pokročilým uživatelem, můžete jednoduše použít Wikipedii. Za zmínku stojí, že pro vědce je web Lifemap stejně primitivní jako Wikipedie, ale nebojte se začít v malém, protože Wikipedie může sloužit jako impuls pro evoluci od jednoduchých ke složitým. Pojďme se tedy společně vyvíjet na wiki. Abychom to mohli udělat, přejdeme do vyhledávače a podíváme se na informace o skupinách, které potřebujeme a se kterými budeme muset v budoucnu pracovat, na tomto webu. První na našem seznamu jsou medvědi. Na stránce webu nemusíme důkladně studovat strukturu, rozmnožování a životní styl medvědů. Potřebujeme tři věci:

1. Sekce vědecké klasifikace.
2. Obor fylogenetiky.
3. Stručné shrnutí klasifikace, které je zobrazeno v pravém horním rohu pod obrázkem s vědeckou klasifikací.

Pojďme do sekce vědecké klasifikace a podívejme se na seznam rodů z čeledi medvědovitých, přičemž si předem zapíšeme název této čeledi v latině (Ursidae). Budeme potřebovat názvy všech rodů v latině, které v čeledi jsou. Je lepší si je také zapsat (obr. 1).

Po dokončení práce přejdeme do sekce fylogenetiky a jako záložní možnost vybereme klad s nejbližšími žijícími příbuznými.

To je nutné udělat v případě, že se nám nepodaří v genové bance najít potřebné genetické sekvence medvědů z různých rodů (obr. 2).

Máme štěstí, podle alternativní verze jsou nejbližšími příbuznými ploutvonožci. Zapišme si název této skupiny, vyberme čeleď a seznam rodů podobných medvědům.

Nyní přejdeme do sekce stručného shrnutí vědecké klasifikace (obr. 3). Najdeme záložku „řád predátorů“ a přejdeme na ni.

Na kartě oddílu přejděte do sekce 4.1. „Externí taxonomie“. Tam musíte najít nadřád, do kterého medvědi patří (obr. 4). Na fylogenetickém stromě je označen jako hypertextový odkaz, klikněte na něj a přejděte do odpovídající sekce.

V této části musíme zjistit postoj primátů k tomuto nadřádu. Abychom to mohli udělat, přejdeme na kartu „klasifikace“ a kupodivu v ní primáty nenajdeme (obr. 5). Ukazuje se, že medvědi podle Wikipedie vůbec nejsou blízkými příbuznými primátů. Možná je to tak, ale kdo by podle Wikipedie byl bratrem primáta?

Abychom toho dosáhli, provedeme podobné manipulace s čeledí křečků a nakonec se dostaneme do řádu hlodavců. Přejdeme do sekce taxonomie a hledáme nadřád (obr. 6).

Jaké překvapení! Objevili jsme lidi v nadřádu Euarchontoglires! Skvělé. Nyní můžeme formulovat hypotézu. Naší hypotézou bude tvrzení, že křečci jsou bratři lidí, a naším cílem je toto tvrzení potvrdit. K dosažení tohoto cíle si musíme stanovit následující úkoly:

1. Vyberte genetické sekvence zástupců rodů studovaných skupin jako interní skupinu v databázi NCBI [2].
2. Na základě vybraných sekvencí z vybraných skupin ukažte spolehlivé vzájemné vztahy.
3. V databázi NCBI vyberte homologní genové sekvence ze skupin zvířat, které se od sebe odchýlily o něco dříve než medvědi, křečci a lidé, jako vnější skupinu.
4. Zarovnejte vybrané sekvence správnou metodou v závislosti na vybraných sekvencích.
5. Vyberte model pro výpočet párových vzdáleností a metodu pro konstrukci evolučního stromu.

Abychom mohli začít definovat metody, musíme si vybrat vnější skupinu a také definovat genetické sekvence. Vnější skupinu potřebujeme k určení polohy kořene stromu, takříkajíc jeho základny. Jako vnější skupina se obvykle používá jeden nebo více kladů, které se od společného stromu oddělily zjevně dříve (ale nejlépe ne o moc dříve) než analyzované sekvence. Protože studujeme fylogenetické vztahy mezi placentárními savci, můžeme jako vnější skupinu použít vačnatce [4]. Ať už jsou to vačice. Miluji vačice. Jsou to kočky světa vačnatců a všichni milují kočky.

Dále definujeme materiály. Jako potřebné materiály jsem se rozhodl vzít ribozomální geny 18S rRNA od dvou zástupců různých rodů z každé ze studovaných skupin. Marker 18S rRNA se používá od konce 70. let 18. století a je univerzální pro systematické konstrukce. Gen kódující 18S ribozomální RNA je přítomen v genomu všech známých eukaryot a je vhodným markerem pro jejich identifikaci; chybí u virů, bakterií a archeí. Gen 3S rRNA obsahuje jak konzervativní oblasti, stejné u všech prokaryot, tak variabilní oblasti. Konzervativní oblasti slouží pro první fázi polymerázové řetězové reakce – přidání primerů ke studované matrici DNA, variabilní oblasti – pro identifikaci druhů. Stupeň podobnosti druhově specifických variabilních oblastí odráží evoluční vztah různých druhů [XNUMX].

S materiály jsme se víceméně rozhodli, nyní je musíme stáhnout z genetické databáze. Přejdeme na webové stránky genové banky a do vyhledávacího řádku zadáme název čeledi latinkou a hledáme genetické sekvence rodů, které jsme dříve zaznamenali. Sekvence by měly být přibližně stejně dlouhé a v žádném případě krátké, protože krátké sekvence nesou málo informací a informace v naší práci jsou zlato, kde fylogenetický strom je zikkurat. A všichni víme, že k sestavení zikkuratu je potřeba více zlata. Proto pro větší pohodlí ve sloupci „Délka sekvence“ nastavíme požadovanou délku sekvencí (1600-2500) a klikneme na tlačítko „Hledat“ (obr. 7).

Na obrázku výše vidíme, že jsem začal s medvědy, bohužel mi genová banka dala pouze tři výsledky a všechny jednoho druhu. Žádný problém, protože medvěda si stejně stáhneme a máme záložní možnost v podobě ploutvonožců (obr. 8) a naštěstí má genová banka pro ně potřebné sekvence.

Tímto způsobem stáhneme všechny potřebné sekvence ve formátu „fasta“. Stažené sekvence nahráváme jednu po druhé (nebo několik, pokud jste si vše stáhli v jednom formátu) do programu MEGA 10, abychom je v budoucnu sloučili do jednoho formátu „fasta“ (obr. 9).

Takže můj výzkumný vzorek zahrnoval 8 druhů. Nebudu vás strašit latinou, jak to obvykle dělám, ale všechny vybrané soudruhy uvedu v ruštině „mat“. První dva druhy na mém seznamu budou představovat jakýsi v reálném světě neexistující vrchol evoluce a, jak jste uhodli, jedná se o lidoopoidní lidoopy – člověka a gorilu. Druhými v hierarchii jsou křečci – hraboš vodní a křeček šedý, třetími uzavírajícími vnitřní skupinu jsou medvědi a tuleni praví – medvěd hnědý a tuleň dlouhonosý. Vnější skupinu reprezentují dva druhy z různých rodů vačic – vačice virginská a vačice domácí. Strom postavíme ve výcvikovém programu MEGA 10.

Nyní musíme začít definovat metody. První důležitou metodou bude zarovnání genetických sekvencí. Zarovnání je důležitá bioinformatická metoda založená na umístění dvou nebo více genetických sekvencí, což nám umožňuje vidět podobné oblasti v těchto sekvencích. Jejich podobnost může zobrazit strukturální a evoluční vztahy, které nelze vytvořit bez zarovnání [5]. V programu MEGA 10 zarovnání provádět nebudeme, protože pro ribozomální sekvence je lepší použít maft [6]. Předtím zkombinujeme všechny sekvence v programu MEGA do jedné a exportujeme ji do libovolné složky na ploše ve formátu „fasta“ (obr. 10).

Uložený soubor nahrajeme na server MAFTA v prohlížeči (obr. 11) a změníme jeden standardní parametr, přičemž vybereme ten, který je zobrazen na obr. 12. Dále klikneme na tlačítko „Odeslat“ a obdržíme výsledek, který je nutné přeformátovat do formátu FASTA, jak je znázorněno na obr. 13.

Výsledný formát je nutné načíst zpět do mega a pracovat v něm. Gratulujeme, zvládli jsme to! (obr. 14)

Před samotnou konstrukcí stromu musíme zkontrolovat zarovnání translace nukleotidů v sekvenci. To nám umožní ověřit správnost našeho zarovnání. Přítomnost hvězdiček v sekvenci nám ukáže přítomnost stop kodonů, což bude signalizovat chybu. Tuto chybu lze odstranit ručním zarovnáním sekvencí, posunutím sekvence o jeden čtvereček doprava. Naštěstí to nebudeme muset dělat, protože vše dopadlo dobře (obr. 15.)

Dále stanovíme párové evoluční vzdálenosti mezi analyzovanými sekvencemi, prezentované jako matice vzdáleností. Jinými slovy, pro konstrukci stromu potřebujeme evoluční model optimální metody pro výpočet evolučních vzdáleností mezi sekvencemi. Jako statistickou metodu použiji metodu pro odhad dat druhové divergence, která byla vyvinuta z hlediska konceptu molekulárních hodin, konkrétně evoluční model Hasegawy, Kishina a Yana 1985.

Tento model rozlišuje míru různých bodových mutací a zohledňuje nestejné základní frekvence, které jednoduché modely [7] nezohledňují. V mega modelech lze tento model zvolit ihned při konstrukci stromu v metodě maximální věrohodnosti, kde také předem nastavíme kontrolu v 1000 replikách (tzv. bootstrap analýza). Tato analýza umožňuje vidět statistickou podporu větví, čím vyšší je, tím lépe. Vysoká podpora pro většinu větví nad 70 % nám umožňuje říci, že strom je sestaven správně (obr. 16). Podpora pod 70 % pro jednu nebo dvě větve není u malého vzorku příliš kritická, ale pokud získáme statistickou podporu pro všechny větve pod 70 %, bude to znamenat velmi špatný výsledek.

Instrumentální mega nám bohužel neumožňuje zobrazit tento model samostatně, ale vypadal by nějak takto (obr. 17).

Tento model byl vyvinut pro konstrukci stromů pomocí metody maximální věrohodnosti, což je v podstatě to, co jsem si zvolil.

Metoda maximální věrohodnosti nám, zjednodušeně řečeno, umožňuje určit neznámý počet parametrů na základě známých experimentálních výsledků. Pokud je například znám počet stěn pravidelného mnohostěnu (tj. počet parametrů), pak můžeme určit, jaké jsou pravděpodobnosti různých výsledků hodu tímto mnohostěnem. Pro šestistěnnou kostku tedy bude pravděpodobnost jakéhokoli výsledku hodu 1/6. Pokud však vezmeme jako hypotézu, že počet stěn určité kostky nám není znám, umožňuje nám tato metoda prostřednictvím vícenásobných opakovaných experimentů ve formě hodů touto kostkou předpokládat počet stěn této kostky a určit věrohodnost tohoto předpokladu. Opakovaným hodem určité kostky s neznámým počtem stěn a pozorováním, že počet různých výsledků hodu kostkou je šest, můžeme předpokládat, že se jedná o šestistěnnou kostku [4]. Proto považuji tuto metodu v tomto případě za jednu z nejlepších pro zodpovězení otázek, které jsem položil.

Jako další vychytávky umožňuje mega využít funkce pro zpřesnění výstupního stromu, což nám dává možnost vypsat původní strom pro heuristické vyhledávání, které se následně používá k vyhodnocení nejlepšího stavu našeho stromu. Podrobně o tom, co je heuristické vyhledávání, se lze dočíst v IT komunitě Habr [5]. Takže v dalších parametrech mega mega můžeme zvolit metodu maximálních úspor, což je kritérium optimality, pro které je nejkratší strom, který vysvětluje data, považován za nejlepší. Tato metoda funguje podle kánonů Occamovy břitvy (obr. 18). V principu si v dalších parametrech můžete vybrat mnohem více, ale myslím, že tohle je docela dost.

Vlastně teď máme vše připravené k ověření pravosti Wikipedie a zároveň naší hypotézy. Pojďme postavit strom! (Obr. 19) ;(Obr. 20)

Voilá – cítím se jako lékař z VU, když je strom úspěšně postaven!

A teď se podívejme, co se nám podařilo, a téměř všechno se nám podařilo perfektně zvládnout!

Jak vidíte, konstruovaný strom nám říká, že hlodavci jsou bližšími příbuznými lidí a potvrzuje naši hypotézu, a to i přesto, že jedna větev má podporu pod 70 %, což v principu není kritické, protože všechny ostatní větve mají statistickou podporu nad 70 %. Samozřejmě si při konstrukci stromu dovoluji drobné chyby, ale celkový obraz byl docela očekávaný a ukázal vše, co je známo samotnému kapitánovi a jeho kapitánské ženě. Křeček je skutečně „bratr“ člověka a medvěd jeho vzdálený příbuzný, a teď si můžeme s úlevou vydechnout! Hodně štěstí!

Materiál jsem napsal/a 26.01.2021. 27.01.2021. XNUMX a publikoval XNUMX. XNUMX. XNUMX v populárně-vědecké komunitě Phanerozoic (https://vk.com/phanerozoi).

1. http://lifemap.univ-lyon1.fr
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=Phocidae+18S+ribosomal+gene
3. Solovjova V.V. Molekulárně genetická analýza bezobratlých pomocí nukleotidové sekvence genu 18S ribozomální RNA: tutoriál / Solovjova V.V., Morov A.R., Rizvanov A.A., Sabirov R.M. – Kazaň: Federální univerzita, 2011 – 52 s.
4. Molekulární evoluce a fylogenetická analýza / V.V. Lukashov – M.BINOM. Laboratoř znalostí, 2009. – s. 256. s. 92-123.
5. Držák DM. Bioinformatika: Sekvenční a genomová analýza. — 2. — Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY., 2004.
6. https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/
7. Hasegawa M., Kishino H. a Yano T. (1985). Datování rozdělení člověka a opice pomocí molekulárních hodin mitochondriální DNA. Journal of Molecular Evolution22: 160-174.
8. https://habr.com/ru/company/mailru/blog/217839/